La rigidez del fago C22 termosensible modula la infectividad del fago

Nov 27, 2023

Scientific Reports volumen 12, Número de artículo: 13001 (2022) Citar este artículo

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Los bacteriófagos ofrecen una alternativa sostenible para controlar las enfermedades de los cultivos. Sin embargo, la falta de conocimiento sobre los mecanismos de infección por fagos hace que el control biológico basado en fagos sea variable e ineficaz. En este trabajo, cuestionamos la dependencia de la temperatura de la infección y el comportamiento de respuesta térmica del fago C22. Este podovirus transmitido por el suelo es capaz de lisar Ralstonia solanacearum, causando la enfermedad del marchitamiento bacteriano. Revelamos que el fago C22 podía infectar mejor la célula huésped patógena cuando se incubaba a bajas temperaturas (25, 30 °C) que a altas temperaturas (35, 40 °C). La medición de la rigidez del fago C22 reveló que la rigidez del fago a bajas temperaturas era de 2 a 3 veces mayor que a altas temperaturas. Además, los resultados de las imágenes mostraron que se adhirieron más partículas de fago C22 a la superficie celular a bajas temperaturas que a altas temperaturas, lo que asoció la rigidez del fago y la unión del fago. El resultado sugiere que la modulación de la estructura y la rigidez en respuesta al cambio de temperatura mejora la infección, lo que proporciona una visión mecanicista del ciclo lítico del fago C22. Nuestro estudio significa la necesidad de comprender las respuestas de los fagos al entorno fluctuante para una implementación eficaz del biocontrol basado en fagos.

La enfermedad del marchitamiento bacteriano causada por Ralstonia solanacearum ha destruido cultivos económicos como la papa, el tomate, el tabaco y el chile, con un costo de alrededor de mil millones de dólares estadounidenses por año1. Las prácticas convencionales como la desinfección del suelo, la enmienda del suelo y la rotación de cultivos requieren mucha mano de obra y son ineficaces debido a la capacidad de las bacterias patógenas para sobrevivir en el suelo durante mucho tiempo y propagarse a las regiones cercanas a través de los canales de agua2,3. El uso de productos químicos y pesticidas para eliminar las bacterias genera residuos nocivos en los productos consumibles, la salud humana y el medio ambiente. Por lo tanto, el control biológico de Ralstonia solanacearum causante de la enfermedad del marchitamiento utilizando agentes antagónicos ha ganado interés como una alternativa segura4,5. Entre tales agentes, los bacteriófagos o fagos líticos demuestran resultados prometedores en el control de bacterias tan dañinas6,7,8,9. Los fagos se dirigen a células bacterianas huésped específicas. Una vez que se erradiquen todas las células huésped, los fagos ya no se replicarán. Los fagos generalmente se reconocen como seguros (GRAS) y no tóxicos para los eucariotas, lo que los convierte en una opción atractiva para prevenir y tratar enfermedades de los cultivos, incluida la enfermedad del marchitamiento bacteriano10,11.

A pesar de las ventajas de los fagos, el control biológico mediado por fagos está infrautilizado debido a su eficacia variable12,13,14,15. El éxito del biocontrol de fagos depende de la infección de la célula huésped bacteriana por fagos, que se rige por varios factores circundantes, como el pH, los iones y la presión osmótica16,17,18. Un factor influyente en todos los microambientes es la temperatura. Los fagos utilizados en el control biológico experimentan constantemente fluctuaciones de temperatura debido al clima diario y las variaciones estacionales en los campos agrícolas. La dependencia de la temperatura de los fagos se ha investigado previamente. Sin embargo, el papel exacto de la temperatura en la infección por fagos sigue sin estar claro. Algunos fagos pueden infectar mejor a sus temperaturas permisivas específicas19,20,21,22. El fago lambda que infectaba a Escherichia coli y los fagos que infectaban a Burkholderia pseudomallei infectaron sus células huésped con mayor eficacia y produjeron más fagos de progenie a aproximadamente 35–40 °C que a aproximadamente 20–35 °C20,22. El estudio de lisis celular de Pseudomonas fluorescens por el fago ɸS1 mostró una mayor tasa de infección a 26 °C que a 37 °C23. Por otro lado, algunos fagos son insensibles a la temperatura. El fago del miovirus T4 lisaba E. coli BL21 de forma eficaz en un rango de temperatura de 15 a 41 °C24. El fago P100 que infectaba a Listeria monocytogenes permaneció infeccioso a 4–60 °C25,26. El fago MR5 que infecta a Pseudomonas syringae, que causa cancro bacteriano, mostró una infectividad similar a 20, 27 y 37 °C27. Comprender cómo la temperatura afecta la infección por fagos puede proporcionar una guía sobre el uso del biocontrol de fagos cuando se combina con datos de pronóstico de temperatura e infección6,28. Por lo tanto, intentamos descifrar el papel de la temperatura de los fagos en el uso de biocontrol.

La influencia de la temperatura en la infección por fagos está regulada por cómo los componentes estructurales de los fagos responden molecularmente a los cambios de temperatura. Al infectar a Listeria monocytogenes, el fago A511 fue más estable a altas temperaturas (60–80 °C) que el fago P100 debido al punto de fusión ligeramente más alto de la proteína conectora de la cápside de la cola del fago A51125. Un estudio sobre el fago T7 mostró que las altas temperaturas redujeron la infección por fago de la cola del huésped, ya que la alta temperatura provocó la ruptura de la cola del fago de la cápside del fago29. Algunos estudios sugirieron que el aumento de temperatura mejoraba la infección ya que proporcionaba más energía térmica para impulsar el genoma hacia las células huésped30,31,32. La comprensión de las interacciones moleculares dentro de las proteínas y estructuras de los fagos en respuesta al cambio térmico revela el mecanismo subyacente de la infección y supervivencia de los fagos. Por lo tanto, se requerirá conocimiento a escala molecular para comprender el efecto de la temperatura, lo que ofrecerá pautas personalizadas para el uso de fagos como agente de biocontrol.

En este trabajo, revelamos el papel de la temperatura en un fago C22 lítico y su infección. El podovirus C22 aislado de una muestra de suelo en Tailandia puede lisar la bacteria patógena Ralstonia solanacearum (Rs), causando la enfermedad del marchitamiento bacteriano en tomate y pimiento33. La enfermedad también destruye otros cultivos de solanáceas como la patata, el tabaco y la berenjena, lo que provoca una pérdida mundial de mil millones de dólares estadounidenses al año34. El fago C22, por lo tanto, presenta un agente antibacteriano prometedor y que se necesita con urgencia para la enfermedad del marchitamiento bacteriano. Estudiamos el efecto de la temperatura en el fago C22 utilizando un ensayo de infectividad basado en placas. Descubrimos que el fago C22 calentado a 25–30 °C puede infectar la célula huésped mejor que el fago C22 incubado a 35–40 °C en aproximadamente un 44 %. Investigamos el efecto directo de la temperatura examinando las partículas de fago C22 incubadas a diferentes temperaturas utilizando técnicas basadas en microscopía de fuerza atómica (AFM). AFM utiliza un voladizo con una punta de tamaño nanométrico para acariciar las partículas de fago adheridas débilmente a una superficie lisa. No requiere ninguna modificación química ni tinción de las partículas del fago, lo que puede dificultar algunos detalles de las partículas o afectar sus propiedades35,36,37. Capturamos las imágenes de los fagos C22 y medimos la rigidez del fago con nanoindentación basada en AFM en un medio líquido a diferentes temperaturas. Los resultados sugieren que la rigidez del fago puede desempeñar un papel crucial en la unión del fago a la superficie de la célula huésped. Dado que la rigidez del fago surge de la integridad estructural de la partícula del fago, nuestros resultados significan la relación de respuesta térmica entre la estructura y la función del fago en el ciclo lítico, que debe entenderse a fondo para el uso práctico del fago.

Examinamos el efecto de la temperatura sobre la infectividad del fago C22 utilizando un ensayo de infectividad basado en placa (ensayo de placa) con una ligera modificación38. En nuestro ensayo de placa modificado, el fago C22 se incubó a cuatro temperaturas (25, 30, 35 y 40 °C) durante 30 minutos antes de mezclarlo con las células Rs e incubarlo en medio de agar CPG. Después de la incubación durante la noche, el número de zonas claras o placas que indicaban la lisis exitosa de las células bacterianas por el fago se registró como unidad formadora de placa por volumen de fago (PFU/mL) denominado título. Los títulos de fagos a 25, 30, 35 y 40 °C se recogieron y normalizaron al 100 % mediante el título medio de fagos registrado a 25 °C. El rango de temperatura en nuestro estudio cubrió una fluctuación de temperatura, que el fago C22 debe soportar en los campos agrícolas de Tailandia39,40.

Los títulos normalizados (Fig. 1) exhibieron una tendencia general decreciente a medida que aumentaba la temperatura. Cuando la temperatura aumentó de 25 a 30 °C, los títulos disminuyeron ligeramente en aproximadamente un 10 % (consulte la Tabla complementaria S1). Los títulos disminuyeron rápidamente en aproximadamente un 44 % cuando la temperatura aumentó de 30 a 35 °C. Finalmente, a medida que la temperatura aumentó de 35 a 40 °C, los títulos se mantuvieron relativamente similares. El resultado mostró que la incubación de 30 minutos provocó alguna alteración en la muestra de fago C22 y condujo al cambio en la infectividad. Por lo tanto, investigamos más a fondo cómo se pudo haber visto afectado el fago C22 durante la incubación a cada temperatura.

Títulos relativos del fago C22 a 25, 30, 35 y 40 °C. La medición del título se realizó por triplicado y la barra de error representaba las desviaciones estándar (sd).

Algunas propiedades del fago C22 pueden cambiar térmicamente o inducirse durante el período de incubación, lo que hace que el título disminuya. Por lo tanto, investigamos las partículas del fago C22 a 25, 30, 35 y 40 °C utilizando técnicas basadas en AFM en un entorno de tampón MES. El AFM capturó un área de 16 µm2, que contenía más de 10 partículas de fago. Las partículas de fago se contaron y clasificaron como sigue. Las partículas separadas individualmente se contaron en la categoría "dispersas". Las colecciones de 2 o más partículas adheridas se contaron en la categoría de "agregación". Los recuentos en cada categoría se normalizaron a sus recuentos totales de partículas, que fueron al menos 1000 partículas en cada temperatura (Figura complementaria S1). Las imágenes AFM de las partículas del fago C22 a cuatro temperaturas mostraron que la mayoría de las partículas del fago C22 (> 90 %) se dispersaron y solo una pequeña porción (< 10 %) de las partículas se agregaron (Figura complementaria S2; Tabla S2).

Debido a un menor grado de movimiento, las partículas de fago agregadas tienen una menor probabilidad de colisionar y adherirse a las células huésped que las partículas dispersas. Como resultado, la agregación de fagos puede provocar una disminución de la infección de las células huésped41,42. El análisis de las imágenes de AFM mostró que la mayoría de las partículas de fago se dispersaron. Este resultado implica que la mayoría de las partículas de fago C22 incubadas a cada temperatura estaban disponibles para unirse e interactuar con las células huésped. La dispersión y agregación del fago C22 a cuatro temperaturas fueron cuantitativamente similares. Por lo tanto, era poco probable que la agregación causara una disminución de la infectividad observada por el ensayo de placas. En cambio, la infección reducida puede ser causada por el cambio en las propiedades de las partículas de fago individuales.

La estructura de las partículas del fago C22 en el tampón MES a 25, 30, 35 y 40 °C se capturó y analizó mediante el método de formación de imágenes sin contacto AFM. Los datos y el análisis de AFM demostraron que la partícula del fago C22 permaneció intacta y morfológicamente similar en las cuatro temperaturas. Una imagen AFM ejemplar del fago C22 en tampón MES a 25 °C (Fig. 2a) mostró una forma icosaédrica con un diámetro de aproximadamente 40 nm (Fig. 2b). La característica angular observada para las partículas de fago pequeñas se hizo evidente para el fago C2243,44. No se observó daño estructural ni desintegración de las partículas del fago al observar de cerca la estructura del fago a cuatro temperaturas (Fig. S3 complementaria). El diámetro promedio de las partículas del fago C22 fue aproximadamente el mismo a cuatro temperaturas (Fig. 2c; Tabla complementaria S3), lo que sugiere que las partículas del fago C22 no se contraen ni se hinchan. Por lo tanto, el daño estructural o la inestabilidad de la partícula de fago no es una causa de la disminución de la infectividad.

El tamaño de una partícula de fago C22 examinada por AFM. (a) Imagen AFM de una partícula de fago C22 en el tampón MES a 25 °C. La barra de escala de degradado de color indicaba la altura (dirección Z). El recuadro naranja demostró una forma icosaédrica. (b) El diámetro de la partícula se extrajo de la sección transversal de la partícula (línea discontinua blanca). (c) El diámetro promedio de las partículas del fago C22 a 25, 30, 35 y 40 °C fue de aproximadamente 40 nm. Las barras de error representaban desviaciones estándar (sd) de 50 partículas.

Aunque las partículas del fago C22 eran morfológicamente similares, otras propiedades estructurales de las partículas del fago aún pueden alterarse entre 25 y 40 °C. Entonces, empleamos otro enfoque basado en AFM denominado nano-indentación para investigar los cambios dinámicos de las partículas de fago. El enfoque marcó la partícula y midió las propiedades mecánicas del fago, como la rigidez y la fuerza de rotura. Tales propiedades están asociadas con pasos críticos en el ciclo de vida viral, como el empaquetamiento del genoma45,46, la transferencia del genoma47,48 y la estabilidad de la cápside29,49. En este estudio, la rigidez de la partícula de fago C22 en el tampón MES a 25, 30, 35 y 40 °C se extrajo y calculó a partir de las curvas fuerza-distancia de la partícula de fago y la mica (Fig. S4 complementaria). Las distribuciones de la rigidez del fago a 25, 30, 35 y 40 °C se generaron a partir de 50 a 60 valores de rigidez del fago a cada temperatura. Las distribuciones se ajustaron por distribución normal para extraer la rigidez representativa del fago C22 (Fig. 3). La rigidez del fago C22 mostró una tendencia decreciente a medida que aumentaba la temperatura (Fig. 4). La rigidez del fago a 30 °C (0,065 ± 0,01 N/m) fue ligeramente menor que a 25 °C (0,071 ± 0,01 N/m). La rigidez del fago disminuyó aproximadamente un 55 % a 35 °C (0,029 ± 0,01 N/m). La rigidez del fago permaneció relativamente inalterada a 40 °C (0,028 ± 0,01 N/m). Presumimos que la disminución de la rigidez podría estar asociada con la disminución de la infección del fago C22 que se observó mediante el ensayo de placa modificado.

Gráficos de las distribuciones de rigidez del fago C22 en tampón MES a 25 (a), 30 (b), 35 (c) y 40 °C (d). Las líneas grises discontinuas eran el ajuste de distribución normal donde los centros (flechas grises) representaban la rigidez del fago a cada temperatura.

La rigidez del fago C22 disminuyó a medida que la temperatura aumentó de 25 a 40 °C. Las barras de error representaban la desviación estándar (sd).

Queda una pregunta obvia: ¿cómo contribuye la disminución de la rigidez del fago a la disminución de la infectividad? Para responder a esta pregunta, investigamos cómo interactuaba el fago C22 con la célula huésped a diferentes temperaturas. Después de incubarse a cada temperatura durante 30 min, el fago C22 se mezcló con las células huésped con la misma multiplicidad de infección que el estudio de infectividad de la placa. La mezcla se investigó con imágenes AFM.

Se midió que el tamaño de una célula Rs (Fig. 5a) era de aproximadamente 1,8 µm de largo y 0,9 µm de ancho. Al estudiar la mezcla del fago C22 y las células, encontramos que las partículas de fago unidas a la superficie celular se podían observar distinguiblemente (Fig. 5b, recuadros e). La unión del fago C22 en la superficie celular sugiere que los receptores potenciales están ubicados en la superficie celular. Los receptores candidatos son proteínas transmembrana o moléculas que sobresalen de la superficie celular (p. ej., lipopolisacárido)31,50. También encontramos los diferentes números de partículas del fago C22 adheridas a la superficie celular. A 25 y 30 °C, muchas partículas de fago C22 se unieron a la superficie celular (Fig. 5b, c), pero a 35 y 40 °C, solo unas pocas partículas de fago C22 se unieron a la superficie celular (Fig. 5d, mi). Más partículas de fago adheridas a la célula huésped implican una mayor probabilidad de que la célula sea infectada por el fago. Los datos indican que el fago C22 incubado a 25 y 30 °C podría infectar a la célula huésped con mayor eficacia que a 35 y 40 °C. Los datos también concuerdan con el resultado del ensayo de placa, que mostró una mejora de la infección a 25 y 30 °C. En combinación con el resultado de la rigidez del fago, proponemos que las partículas de fago C22 relativamente rígidas a 25 y 30 °C podrían unirse a la superficie celular e infectar la célula huésped mejor que las partículas de fago C22 relativamente blandas a 35 y 40 °C.

Imágenes ejemplares de AFM del fago C22 y células Rs a diferentes temperaturas. (a) Una imagen AFM de una célula Rs sin el fago C22. AFM investigó el fago C22 incubado a 25 °C (b), 30 °C (c), 35 °C (d) y 40 °C (e) mezclado con células Rs. Las partículas de fago C22 individuales podrían distinguirse en los recuadros (b, e). La barra de escala de gradiente de color era la escala de la amplitud vertical (dirección Z). Las barras de escala blanca en los paneles (a-e) eran de 500 nm y las del recuadro eran de 100 nm.

En este trabajo, encontramos que la infección de las células Rs por el fago C22 disminuyó a medida que incubamos el fago C22 a temperaturas crecientes de 25 a 40 °C. La temperatura debe causar algunos cambios en las partículas del fago C22 dentro de este rango de temperatura, lo que resulta en una disminución de la infectividad. Tras la inspección, las partículas de fago estaban principalmente no agregadas, eliminando la agregación como causa probable de infección reducida. La investigación adicional de partículas de fagos individuales reveló que las partículas no mostraban cambios morfológicos cuando se incubaban a temperaturas crecientes; sin embargo, se redujo la rigidez de las partículas. El aumento de la energía térmica podría mejorar la vibración local de las proteínas de la cápside y el ADN, lo que debilitaría la interacción atractiva entre los capsómeros y las cadenas de ADN de doble cadena (ds), lo que disminuiría la rigidez51. Estudios computacionales previos sugirieron que las cápsides virales pueden sufrir una transición de "fluidez" con el aumento de la temperatura52. Bajo esta transición, la separación promedio entre los capsómeros supera un umbral específico, expresando una mayor flexibilidad de la cápside y una menor rigidez. Una disminución en la rigidez del dsDNA densamente empaquetado también puede desempeñar un papel en la reducción de la rigidez del fago debido a una transición de sólido a fluido del dsDNA dentro de las cápsides virales32,48. La estructura del ADN se volvió más desordenada y mostró una menor rigidez cuando aumentó la temperatura. En conjunto, la cápside del fago C22 y el dsDNA interno probablemente experimentan transiciones similares, lo que contribuye a la disminución de la rigidez.

Especulamos que la disminución de la rigidez regulaba la infección de la célula Rs. El descubrimiento de que la disminución de la rigidez estaba asociada con la reducción del número de partículas de fago adheridas a la membrana celular reforzó nuestra hipótesis. En otras palabras, la rigidez decreciente inducida térmicamente de la partícula del fago C22 dificulta la eficacia de la unión, reduciendo así la infección de la célula huésped por el fago C22. El hallazgo nos insta a explorar el papel de la rigidez del fago en la unión del fago en el ciclo de infección. Un modelo clásico de adsorción de fagos muestra que la unión se inicia mediante el reconocimiento entre las fibras o puntas de la cola del fago y el receptor de la célula huésped53,54. La rigidez del fago emana principalmente de la proteína de la cápside y del dsDNA empaquetado internamente debido a su abundancia32,45,55,56. Por lo tanto, el efecto de la rigidez del fago puede originarse en las proteínas de la cápside y el ADN y propagarse a las proteínas de la fibra y la espiga. Presumimos que las proteínas portales pueden realizar esta diseminación mecánica propuesta57,58. Se ha demostrado que esta estructura dinámica que conecta el conjunto cápside-ADN y las proteínas de la cola es flexible y se comporta como un sensor mecánico que detecta la alteración estructural general59,60. Una partícula de fago de mayor rigidez infiere una estructura de cápside más compacta y un ADN61 estrechamente empaquetado. Tal estructura puede poseer una distancia intermolecular más pequeña y, a su vez, propagar mecánicamente los cambios estructurales mejor que una partícula de fago de menor rigidez. Por ejemplo, se puede promover el movimiento de las fibras de la cola o las puntas durante la unión. La eyección de ADN puede ser impulsada por la propagación de la extensión o compresión de la proteína portal mejor en una partícula de fago de mayor rigidez que en una menor rigidez62,63. Los mecanismos precisos a nivel molecular requieren un mayor estudio estructural, que se llevará a cabo en trabajos futuros.

Además, la temperatura puede influir en la infectividad de los fagos a través de mecanismos adicionales. La temperatura puede inducir cambios conformacionales o dañar las proteínas de la fibra y las espigas afectando sus propiedades (p. ej., flexibilidad) y la unión del virus19,64. La temperatura también puede aumentar el movimiento estocástico de las partículas del fago, lo que influye en los eventos de unión y liberación entre las proteínas de unión del fago y los receptores de la célula huésped65,66. La temperatura puede afectar la expresión de genes o proteínas involucradas en el proceso de infección67,68. Sin embargo, el alcance del efecto de la temperatura sobre los componentes estructurales no está claro debido a la naturaleza transitoria de la interacción fago-huésped.

En nuestro estudio reciente, la rigidez del fago C22 varió con diferentes pH y fuerzas iónicas, pero la eficiencia de adsorción se mantuvo relativamente constante35. Los resultados de AFM en este estudio revelaron lo contrario. Al aumentar la temperatura, se redujo el número de partículas de fago C22 en el paso de adsorción, lo que puede vincularse a la disminución de la rigidez de la partícula de fago C22. Esta discrepancia probablemente se deba a los métodos utilizados para investigar la adsorción de fagos. El estudio anterior se basó en la cantidad de partículas de fago no adsorbidas en el sobrenadante después de la precipitación de las células adsorbidas por fago. Este enfoque experimental no investigó directamente la adsorción de las partículas de fago en la superficie celular. En este estudio, visualizamos directamente la unión del fago C22 en la célula huésped, lo que proporciona una vista real de los eventos de unión in situ con mayor resolución y precisión.

La dinámica de la rigidez viral resulta del ajuste molecular de la partícula del virus para maximizar su probabilidad de infección. La modulación de la rigidez probablemente depende del tipo de virus y, a su vez, de los componentes estructurales de respuesta. Nuestro estudio anterior mostró que la alta infectividad del fago C22 está asociada con su rigidez intermedia35. El diminuto virus de los ratones relajó los capsómeros de la cápside y el enlace capsómero-portal de la cola, lo que provocó una menor rigidez mecánica y una mejor infección69. El fago lambda y el virus del herpes simple tipo 1 promovieron la transferencia de ADN a las células huésped al disminuir la rigidez del ADN32,48,70,71. El virus de la inmunodeficiencia humana redujo la rigidez de su membrana a través de la maduración para mejorar la entrada celular72. Por lo tanto, la regulación de la rigidez puede considerarse un mecanismo de retroalimentación para que los virus se ajusten a la supervivencia y la replicación.

Nuestros resultados significan los aspectos estructurales y nanomecánicos de respuesta térmica del ciclo lítico del fago, que deben entenderse a fondo para el uso práctico del fago en el manejo de enfermedades de cultivos. Comprender la infección por el fago C22 nos permitirá idear cómo el fago C22 debe usarse de manera efectiva en los campos con temperaturas fluctuantes en aplicaciones de biocontrol. Por ejemplo, los agricultores deben usar el fago C22 durante los períodos con temperaturas más bajas (25 a 30 °C), ya que es probable que la infectividad del fago C22 se reduzca cuando la temperatura alcanza los 35 a 40 °C. El conocimiento de este estudio y la disponibilidad de tecnología agrícola de precisión, como sensores de temperatura del suelo e IoT, ayudarán a los agricultores a monitorear el estado del medio ambiente y administrar adecuadamente el biocontrol de fagos28,73.

Un cultivo de una noche de Ralstonia solanacearum cepa RS3/1-1 (raza 1 biovar 4) a 28 °C y agitación de 230 rpm se diluyó a OD600 de 0,25 con medio CPG fresco que contenía 0,1 % (p/v) de casaminoácidos, 1 % de ( p/v) peptona y glucosa al 0,5% (p/v). La purificación del fago C22 se describió en otra parte35. El sedimento de fago C22 se resuspendió en el tampón MES que constaba de ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico 0,05 M o MES (Sigma-Aldrich) pH 6,0, NaCl 0,1 M y MgSO4 0,05 M y se almacenó a 4 °C35,74.

Un cultivo de la noche a la mañana de la cepa RS3/1-1 de Rs a 28 °C y agitación de 230 rpm se diluyó a una DO600 de 0,25 con medio CPG nuevo. Para el primer caso (fago incubado), se incubaron 100 μL del fago C22 en tampón MES a cada temperatura (25, 30, 35, 40 °C) durante 30 min. Después de eso, 10 μL de la suspensión de fagos incubados se mezclaron con 250 μL de cultivo Rs diluido. Después de una incubación de 30 minutos, se añadió a la mezcla agar fundido al 0,45 % en un medio CPG y se superpuso en una placa CPG que contenía agar al 1,5 %. Después de la incubación durante la noche a 28 °C, se registró el número de placas. El ensayo de placas se realizó por triplicado.

Mica (grado V1, Ted Pella) se revistió por separado con dos productos químicos. El primer producto químico fue una solución de poli-l-lisina (PLL) (Sigma-Aldrich). Se cortó una mica y se incubó en una solución de PLL al 0,1 % (p/v) durante 15 min. La mica se enjuagó con agua desionizada y se secó con gas nitrógeno. Se usó una mica recubierta de PLL para inmovilizar las células Rs. El segundo producto químico fue (3-aminopropil) trietoxisilano (APTS) (Sigma-Aldrich). Se escindió una mica y se incubó en una solución de APTS al 1 % en agua desionizada con agitación a 50 rpm durante 15 min. La mica se enjuagó con agua desionizada y se secó con gas nitrógeno. Se usó una mica recubierta con APTS para inmovilizar las partículas del fago C22.

Para las imágenes de AFM de células Rs, el fago C22 se incubó a cada temperatura (25, 30, 35, 40 °C) durante 30 min. Luego, el fago incubado se mezcló con la célula Rs durante 30 minutos y posteriormente se incubó en la mica recubierta con PLL durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de eso, las células inmovilizadas sobre el sustrato de mica se lavaron con agua desionizada y se secaron con gas nitrógeno. Las mediciones de imágenes de AFM se realizaron con un NanoWizard 3 BioScience AFM (JPK-Bruker). Las imágenes se recopilaron en el modo sin contacto (modo AC) en condiciones ambientales. Durante la captura de imágenes, el voladizo AFM (modelo ACTA, AppNano) con una punta de tamaño nanométrico en el extremo osciló mientras el voladizo escaneaba la superficie de la muestra (los ejes X e Y). La amplitud de oscilación de respuesta en el eje vertical (Z) se registró como las imágenes de amplitud de la superficie de la muestra.

Para las imágenes de AFM del fago C22 y la nanoindentación, se incubó una gota de 100 μL del fago C22 en tampón MES con (~ 1012 pfu/mL) a cada temperatura (25, 30, 35, 40 °C) durante 30 min. Se incubó una gota de 50 μL de la suspensión de fagos incubados con el sustrato de mica tratado con APTS durante 30 minutos antes del experimento AFM. La temperatura de la muestra de AFM comprobada por un termómetro digital (421TK, Ponpe Instruments) se mantuvo constante en cada temperatura con una etapa de calentamiento (PetriDish Heater, JPK-Bruker). Las imágenes del fago C22 se capturaron en el modo sin contacto (modo AC). La rigidez de las partículas de fago se midió en el modo de espectroscopia de fuerza del AFM. Se utilizó un voladizo BioLever mini BL-AC40TS-C2 (Olympus) con una constante de resorte de 0,02–0,14 N/m determinada por ajuste térmico. Brevemente, la curva de fuerza-distancia (FD) registró la muesca de la punta de AFM en la región central de la partícula de fago. Las pendientes extraídas de la región lineal de las curvas FD en la partícula y la mica se calcularon para la constante de resorte o rigidez de la partícula del fago (Fig. S3 complementaria). Los detalles del cálculo se describieron en otro lugar32,45,45,75.

A cada temperatura (25, 30, 35, 40 °C), se midieron 50–60 valores de rigidez de 15 a 20 partículas de fago para generar una distribución de rigidez. Se ajustó una función gaussiana (distribución normal) a la distribución de rigidez empírica utilizando la función de densidad de probabilidad normal, software de código abierto en Python76. El centro del pico que representa la rigidez del fago y la desviación estándar (sd) se extrajeron del ajuste. Luego se calculó la desviación estándar al error estándar (sem) de la rigidez75,77. Todas las figuras de la trama en el manuscrito fueron generadas por la biblioteca Mathplotlib en Python78.

Todos los datos generados o analizados durante este estudio se incluyen en este artículo publicado y su archivo de información complementaria.

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Esta investigación ha recibido apoyo financiero de la NSRF a través de la Unidad de Gestión de Programas para Recursos Humanos y Desarrollo Institucional, Investigación e Innovación (Número de subvención B16F640116); Fondo de Investigación de Tailandia (Número de subvención TRG6280009); y Centro Nacional de Ingeniería Genética y Biotecnología (BIOTEC), Agencia Nacional de Desarrollo de Ciencia y Tecnología (NSTDA), Tailandia (número de proyecto P21-51892). Los financiadores no tuvieron ningún papel en el diseño del estudio, en la recopilación, análisis o interpretación de datos, en la redacción del manuscrito o en la decisión de publicar los resultados.

Centro Nacional de Ingeniería Genética y Biotecnología (BIOTEC), Agencia Nacional de Desarrollo Científico y Tecnológico (NSTDA), Pathum Thani, 12120, Tailandia

Udom Sae-Ueng, Anjana Bhunchoth, Namthip Phironrit, Orawan Chatchawankanphanich, Ubolsree Leartsakulpanich y Penchit Chitnumsub

Centro Nacional de Nanotecnología (NANOTEC), Agencia Nacional de Desarrollo de Ciencia y Tecnología (NSTDA), Pathum Thani, 12120, Tailandia

Alongkot Treetong y Chaweewan Sapcharoenkun

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Todos los autores concibieron los experimentos. US, AB, NP, AT y CS realizaron los experimentos. US, OC, UL y PC analizaron los resultados. Todos los autores revisaron el manuscrito.

Correspondencia a Udom Sae-Ueng.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Sae-Ueng, U., Bhunchoth, A., Phironrit, N. et al. La rigidez del fago C22 termosensible modula la infectividad del fago. Informe científico 12, 13001 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-16795-y

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Recibido: 23 Abril 2022

Aceptado: 15 julio 2022

Publicado: 29 julio 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-16795-y

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